非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒（间接法）使用操作说明书

【名称】

非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒（间接法）使用操作说明书

【作用与用途】

用于检测猪血清中的非洲猪瘟（ASF）病毒抗体，评估养猪场ASF病毒疫苗免疫状况及感染猪的血清学辅助诊断。

【检测原理】

非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒采用间接ELISA法，在酶标板条微孔上预包被基因重组的ASF病毒抗原。在实验中，加入稀释后的待检血清，经过温育后，若样品中含有ASF病毒特异性抗体，则与酶标板上的抗原结合；经洗涤后除去未结合的抗体和其他成分后，再加入酶结合物，与酶标板上的抗原抗体复合物发生特异性结合；再经洗涤除去未结合的酶结合物；在微孔板中加入底物液，经酶催化形成蓝色产物，加入终止液终止反应后，用酶标仪450 nm波长测定反应孔中的吸光度OD值。

【主要成分与含量】

【需自备的材料】 去离子水、微量移液器、酶标仪（450 nm）、计时器、37 ℃ 温箱、离心机（4000 rpm）等。

【用法与判定】

1、用法

1.1 试剂配制

洗涤工作液：使用前，浓缩的洗涤液应恢复至室温（20～25℃），并摇动，使沉淀溶解（最好在37℃恒温培养箱中加热5～10 min），然后用蒸馏水作10倍稀释（例如：75 mL的浓缩洗涤液加上675 mL蒸馏水）混匀，稀释好的洗涤液2～8℃可存放7日。

1.2 样本处理

① 取动物全血，待血液凝固后，4000 rpm离心10 min，收集上清。也可以自然凝固析出血清，无溶血。

② 在血清稀释板中按1:50稀释待检血清样品（245 µL样本稀释液中加5 µL待检血清样品），充分混匀。

注：阴、阳性对照不用稀释。

1.3 操作步骤

① 取酶标板（根据样品多少，可拆开分次使用），将稀释好的待检血清取100 µL加至酶标板中。同时设阴、阳性对照各2孔，取阴性、阳性对照各100 µL分别加入反应孔中。轻轻振匀孔中样品，盖上盖板膜，37℃温箱中避光反应30 min。

② 弃去孔中的溶液，每孔加入稀释好的洗涤液300 µL，静置1 min后，弃去洗涤液。洗涤4次后在吸水纸上拍干。

③ 配制酶结合物工作液:按体积比1:100（1份酶结合物浓缩液+99份酶结合物稀释液）混匀备用。

④ 每孔加酶结合物工作液100 µL，盖上盖板膜，37℃温箱中避光反应30 min。

⑤ 弃去孔中的溶液，洗涤4次，方法同②。

⑥ 将底物A液与底物B液按1:1混合，加入孔中，100 µL/孔，盖上盖板膜，37℃温箱中避光反应15 min。

⑦ 每孔加入终止液50 µL，5 min内测定结果。

2、判定

在酶标仪上读各孔OD450nm值。

① 试验成立的条件：

阴性对照平均OD450nm值＜0.20且阳性对照平均OD450nm值≥1.0，试验结果才有效；否则，应进行重复试验。

② 计算方法：

③ 阴阳性判断：

S/P＜0.2时，判为阴性；S/P≥0.2时，判为阳性。

【注意事项】

1、试剂盒使用前各试剂应平衡至室温。使用后放回2~8℃保存。

2、不同批号的试剂盒组份不得混用，不同试剂使用时应防止交叉污染。

3、底物液和终止液不能暴露于强光或接触氧化剂。

4、待检血清数量较多时，应先稀释完所有待检血清，再加到抗原包被板上，使反应时间一致。

5、稀释10×浓缩洗涤液时，如发现有结晶，应加热使其溶解后再使用。

6、移液时，应尽量准确，防止产生气泡。

7、应严格遵守各操作步骤规定的时间和温度。

【贮藏与有效期】2～8℃避光保存，有效期为12个月。

【规格】96孔/盒；192孔/盒

【生产企业】

北京中海生物科技有限公司

中海生物技术（枣庄）有限公司

网址：www.zhzbio.com

仅供兽医诊断使用

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