非洲猪瘟ELISA抗体检测试剂盒的使用及注意事项

酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，简写ELISA）指将抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体特异性结合进行免疫反应的检测方法。其基本原理如图1所示。目前，非洲猪瘟ELISA抗体检测试剂盒的原理主要有三种，分别是间接法、阻断法（竞争法）和双抗原夹心法。

1. 间接法

间接法通常用于测定血清中的IgG抗体，由于只要获得抗原，配合通用的酶标抗猪IgG的二抗就可以快速建立ELISA方法。产品性能取决于抗原的纯度，抗原纯度不够会导致非特异IgG的结合，产生假阳性。其主要原理如图2所示。

2. 阻断法

阻断法又叫竞争法，通常用于测定血清中的IgG抗体。阻断ELISA需要抗原和特异性的单抗或多抗。对抗原的纯度要求不高，产品的性能取决于单抗或多抗的特异性和亲和力。背景干扰低，特异性高。阻断ELISA方法的原理如图3所示。

3. 双抗原夹心法

双抗原夹心ELISA用于测定血清中IgG、IgM、IgA等总抗体。技术难度最高，需要制备高质量的酶标抗原。该方法不受非特异性IgG的干扰，背景干扰小，敏感性和特异性高。其原理如图4所示。

非洲猪瘟ELISA抗体检测试剂盒的使用及其操作步骤详见试剂盒说明书。另外，在使用试剂盒时，应注意以下事项：

1. 检测样本的注意事项

如果样本处理或保存不当，会出现溶血等情况，红细胞破裂，血红蛋白溢出，红细胞中的各种蛋白和酶使血清成分变的复杂，尤其亚铁血红素具有HRP酶的作用，从而会影响检测结果。

样品溶血主要由以下原因造成：①采血后，不离心，连同针管一同邮寄；②采血后，低温冷冻，然后解冻；③采血后，未及时静置，有剧烈震荡的情况。

避免溶血应注意以下几点：①采血后，静置2h以上 （室温），或采血后，静置30min后再离心（离心过早，胶冻样血清），静置或离心出血清后，及时分装到EP管中妥善保存。②冷链运输样本；③样本的保存：室温不超过8h，4℃不超过5天，-20℃可长期保存；④检测时，应充分回温并混匀，避免反复冻融；⑤严格按照试剂盒的稀释比例，稀释血清样品。

2. 检测环境的控制

检测期间，注意实验室的温度、光照和通风情况，应保证在室温（18℃~25℃）条件下操作，不在太阳直射或空调出风口下试验。操作桌面应保持整洁，无挥发性液体。

3. 规范样本稀释、加样、转移等操作规程

加样用样本的稀释，应先加稀释液，再加待检血清。

加样期间，所加物应加注到ELISA板孔底部，不要黏附在孔壁上。板孔内液体轻轻摇晃，不要将液体溅出孔外，更不要产生气泡，避免有弱阳性样品显假阴性。

正确使用移液枪，确保移液枪的量程准确，移液枪头与移液枪是否匹配，移液的过程中尽量避免气泡的产生。建议采用“吸二打一”的方式，“吸二打一”的方法：也就是吸液时移液器按到底，打液时，按到移液器第一个停止位置，慢吸液体，快速打下液体，枪头需垂直于板孔，不可插入板孔，避免溶液挂壁和交叉污染。

4. 洗板应注意的问题

按说明书操作，确保每孔所加洗涤液量的准确和均一，间隔30s，人工清洗需5次，机洗3次即可，调好针头与孔底的距离，过多会溢出板孔，污染其它样本，过少则达不到洗涤的效果。

快速甩尽板孔内的液体。防止板孔里的液体对流，产生交叉污染，最后一次洗板后，用吸水纸垫厚毛巾拍干。拍干后观察板孔，未被清除的气泡用未使用过的枪头戳破或洗耳球轻轻吹破。

5. 试剂盒使用的注意事项

试剂盒应在2-8℃保存，不要贴冰箱壁，避免结冻。板条若未能一次用完，剩余板条用塑料袋封口后密封2-8℃保存。

试剂盒使用前应提前拿出至室温，待回温后方可使用，回温时不要使用水浴或温箱回温。

使用前充分混匀，吸出的多余液体禁止倒回。

为确保检测的结果准确，不同批次的试剂盒的试剂成分都要经过优化处理，同时要避免不同批次间的试剂盒成分的混合使用。