改良Frey氏培养基使用说明书-中海生物

【产品名称】

中文名称：改良Frey氏培养基

英文名称：Frey Medium,Modified

汉语拼音：Gailiang Freyshi Peiyangji

【性    状】  液体培养基为澄清、玫瑰红色液体；固体培养基为淡黄色固体，加热融化后无絮状物或沉淀；固体培养基辅助液为淡黄色或玫瑰红色液体。

【作用与用途】  用于检验禽源兽用生物制品中的支原体。

【用法与判定】

1. 液体培养基  分装后使用。分装量为：小瓶20ml/瓶，小管1.8ml/支。

2. 固体培养基  将固体培养基基础成分加热融化，当温度降到60℃左右时添加辅助液（60ml固体培养基+13ml辅助液），混合均匀后按平皿规格加入适量培养基（例如直径60mm的平皿加入固体培养基9ml）制成固体平板。

3. 检验  取样品5ml接种小瓶液体培养基，混匀后再从小瓶中取液体，分别移植到2支小管液体培养基（0.2ml/支）、2付固体平板（0.1~0.2ml/付），将小瓶与小管放37℃培养，固体培养基放置37℃、5%CO₂培养箱中培养。接种后第5日、第10日、第15日从小瓶中取培养物移植2支小管液体培养基（0.2ml/支）和2付固体平板（0.1~0.2ml/付）。每日观察培养物颜色有无变黄或变紫红的现象，若无变化，在最后1次移植培养14日后停止观察。在观察期内，如小瓶或任何1支小管培养物颜色出现明显变化（pH变化达±0.5）时，应立即移植于2支小管液体培养基和2付固体平板进行培养，观察液体培养基是否出现恒定的pH变化以及固体培养基有无支原体菌落生长。

每次检验时，均应同时设立阴、阳性对照。阳性对照为接种1~10CFU/0.2ml质控菌液（鸡滑液支原体GX11-T株）的小管液体培养基，和接种1~50CFU/0.2ml质控菌液的固体平板培养基；阴性对照为接种灭菌生理盐水的小管液体培养基和固体平板培养基，同上法培养和观察。

4. 结果判定

4.1 检测结果有效性  当阳性对照液体培养基出现颜色变黄，固体平板上出现支原体菌落；阴性对照液体培养基不变色，固体平板上无支原体菌落时，检验有效，并作如下判定。

4.2 判定  若接种样品的小瓶或小管培养基出现颜色变黄，且固体平板上可见支原体菌落，则判该样品有支原体污染。

【注意事项】

1. 培养基若自低温环境取出，恢复到室温后使用。

2. 制备固体平板时，辅助液应沿着瓶壁加入，添加后轻轻摇动，避免出现气泡。

3. 进行培养基灵敏度检验时的试管或吸管，建议按组织细胞培养要求清洗，或使用一次性无菌试管。否则，可能会有近半数左右的灵敏度低一个滴度。

4. 如液体培养基出现浑浊或变色，固体培养基平板表面干裂，应停止使用。

【规    格】  改良Frey氏液体培养基80ml/瓶；改良Frey氏固体培养基60ml/瓶；改良Frey氏固体培养基辅助液13ml/瓶。

【贮藏与有效期】  改良Frey氏液体培养基-20℃以下保存，有效期为12个月；改良Frey氏固体培养基2~8℃保存，有效期为12个月；改良Frey氏固体培养基辅助液-20℃以下保存，有效期为12个月。

附：培养基检验

1. 质控菌株  检验用质控菌株为鸡滑液支原体GX11-T株。将冻干种子恢复原量以10%的量接种改良Frey氏液体培养基，经35~37℃培养至变色，作为第1代；将第1代培养基物按10%接种量接种改良Frey氏液体培养基，35~37℃培养12~72h，取活菌滴度≥10⁸CCU/ml培养物作为工作种子。在使用过程中冻干种子传代次数不超过5代，工作种子在-20℃以下保存有效期为30日。

2. 检验方法

2.1 灵敏度试验

（1）培养  取工作种子液用待检液体培养基进行10倍系列稀释至10^-10，另设1支未接种液体培养基作为对照，置35~37℃培养5~7日；取10^-6稀释度菌液0.2ml接种于固体培养基平板1个，另设1个未接种固体培养基平板作为对照，置37℃、5%CO₂培养箱中培养5~7日。同时各做2组重复。

（2）结果判定  以培养基呈现生长变色的最高稀释度作为其灵敏度。如果2组培养基灵敏度均≥10^-8，对照不变色；固体培养基均有支原体菌落生长，对照无支原体菌落生长，判培养基合格。若仅1组液体培养基灵敏度≥10^-8，或1组固体培养基有支原体菌落生长，取2倍待检品重检。重检后，如液体培养基灵敏度均≥10^-8，固体培养基均有支原体菌落生长，判为合格。否则，判为不合格。

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