鸡传染性支气管炎病毒（M41株）血凝抑制试验抗原、阳性血清与阴性血清使用说明书

本抗原系用鸡传染性支气管炎病毒（M41株）接种SPF鸡胚，收获尿囊液，经A型魏氏梭菌菌液活化制成。血凝效价不低于1:128，用于检测鸡传染性支气管炎的抗体；阳性血清系用M41株病毒接种SPF鸡制备的免疫血清；阴性血清为SPF鸡血清。

【用法与判定】

1  IB HA工作抗原的制备

1.1  IB HA 抗原效价测定

1.1.1  用移液器在96孔微量板上从第1孔至第12孔，依次加入30μl稀释液。

1.1.2  取30μl IB HA抗原加入第1孔，依次作2倍系列稀释至第11孔后弃去30μl稀释液，各孔均应混合均匀。

1.1.3  每孔加入1%鸡红细胞悬液30μl，再补加30μl稀释液（保证与HI试验同反应体积），同时设立红细胞悬液对照孔。

1.1.4  将96孔板至振荡器上振荡10s，置2~8℃作用45min～60min分钟，判定结果。判定时，将微量板倾斜45°，30s内观察结果，对照孔红细胞应完全沉淀到孔底并呈泪珠样流滴（不凝集—），HA阳性孔红细胞应均匀分布于孔内（完全凝集#）或少量沉淀但不呈泪珠样流滴（不完全凝集++），使红细胞完全凝集的最大稀释倍数判为该抗原的HA效价。

上表所示血凝抗原的血凝价为1:128。

1.2. 抗原工作液配制及检验

1.2.1  4个HA单位（4HAU）的工作抗原的配制：如果IB HA抗原的HA效价测定结果为1:128，则4个HA单位为128/4=32，将HA抗原用稀释液稀释32倍，即为4HA单位的工作抗原液。

1.2.2  回归试验：在96孔V型板中选取6列4行，每列均加入30μl PBS，第2列加入60μl PBS，第6列加入120ul PBS。在第1列前3行中加入稀释好的4HAU 30μl（2倍稀释），用移液器（排枪）反复吹打10次后，吸取30μl加入第3列（4倍稀释），反复吹打10次后吸取30μl加入第5列（8倍稀释），反复吹打10次后，弃去30μl。

在第2列前3行中加入稀释好的4HAU 30μl（3倍稀释），用移液器反复吹打10次后，弃去30μl，再吸取30μl加入第4列（6倍稀释），反复吹打10次后，弃去30μl。在第6列前3行中加入稀释好的4HAU 30μl（5倍稀释），用移液器反复吹打10次后，弃去120μl，每孔加入30μl PBS，再加入30μl 1％红细胞悬液，室温静置30min～45min，对照孔的红细胞全部沉淀时，观察判读结果。

1.2.3  4单位抗原配制：根据回归试验结果，配制4HAU。例如回归试验结果为1:5，则将抗原稀释40倍（假设抗原血凝效价为1:128，初步4单位抗原为1:32，根据回归结果，抗原应稀释倍数为32×5÷4即可，也应采用两步稀释法）。

2 血凝抑制试验（HI）

2.1 血凝板每排检测1份被检血清，设阳性血清与阴性血清对照。

2.2 第1孔～第10孔，每孔加入30μl PBS，第11孔加入30μl（抗原对照孔），第12孔加入60μl（红细胞对照孔）。

2.3 取待检血清30μl加入第1孔中（悬空加入，枪头弃去，更换新枪头进行稀释），用移液器对待检血清作倍比稀释至第10孔：即将第1孔用移液器反复吹吸10次后，吸出30μl移至第2孔，再反复吹吸10次后，吸出30μl移至第3孔，依此类推至第5孔更换一次枪头，继续稀释至第10孔，从第10孔中吸出30μl弃去，如表3。

2.4 第1～11孔，每孔加入4 HAU 30μl，轻微振荡后置于2~8℃反应30min。

2.5补加红细胞及试验结果判定：作用30min后将配制好的1%鸡红细胞加入各板中，30μl/孔，置于2~8℃作用，反应30~45min（红细胞对照完全沉淀时）读取HI试验结果，读取完全中和孔的稀释倍数（45°角倾斜板，10s内红细胞呈泪滴状下滑，周围液体清亮无混浊）做为判定结果。

上表所示待检血清抑制价1:64。

【注意事项】

1. 试剂盒储存于2~8℃，使用前不需要回温，试验结束后放回2~8℃保存

2. 试验应在室温条件下进行，每次检测时应设阳性、阴性血清（稀释方法同被检血清）及红细胞对照。

3. 抗原工作液应现配现用，使用时必须充分摇匀。

4. 应将使用剂量的抗原无菌吸出，剩余抗原及时放回冰箱保存。

5. 只用于检测鸡血清，不能用于鸡全血反应。

【规格】 抗原 1ml/瓶，1瓶；稀释液 200ml/瓶，1瓶；阳性血清1ml瓶，1瓶；阴性血清1ml/瓶，1瓶。

【贮藏与有效期】 2～8℃保存，有效期为24个月。

【生产企业】 中海生物科技有限公司

仅在兽医指导下使用

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