解析微生物检验培养基制备的九个步骤关注要点

微生物检验培养基制备有多少步骤？每步应怎么操作？今天中海生物技术zhzbio.com为大家解析微生物检验培养基制备的九个步骤关注要点。

步骤一：称取数量

用1/100的电子天平称出培养基所需的药物。首先参照配方计算出配制相应培养基需要各成分的数量，然后用电子天平准确称取重量（将称量纸折叠成簸箕盛药）。 

步骤二：培养基溶化

将中海培养基纳入烧杯容器中，加小适量的水，缓慢加水并用玻璃棒小幅度搅拌。倘若培养基中不含琼脂，则不需要对培养基加热；相反含有琼脂，就需要用本生灯/电磁炉加热煮沸。待培养基完全溶解后再加入适量的水搅拌均匀。如准备的北京中海培养基较多，在不锈钢锅中融化加热，可以用温水加热，需不停搅拌，防止焦化。如果不小心出现焦化现象，则制备好的培养基将无法使用，必须重新配制中海生物培养基。

不要使用铜或铁容器溶解制备培养基，因为铜或铁容器可能会导致容器内培养基中铜、铁超标，影响实验结果，其中培养基中铜含量大于0.3毫克每升，细菌不适宜生长。 

铁含量超过0.14毫克每升，防止细菌产生毒素。容易发生反应和沉淀的药物应单独溶解，然后加入培养基中，如磷酸氢二钾和硫酸镁。

步骤三：调培养基pH

虽然中海培养基中含有缓冲物质，可以尽量使培养基的pH值保持在标准范围内，但如果配制的培养基不能要求，则必须进行必要的调整。如果您有校准过的 pH 计，则可以使用 pH 计。如果没有，可以使用精确的pH试纸，然后根据需要使用1 mol/L氢氧化钠或1 mol/L盐酸进行微调。使用 0.1 氢氧化钠或 0.1 mol/L 盐酸进行调整至所需的pH值。

培养基有酸性或碱性，pH值一般为7.4～7.6。对于需要用氢氧化钠高压灭菌的介质，将pH调至比要求值高0.1～0.2个单位，因为用氢氧化钠调节时，高压灭菌后介质的pH值要降低0.1 ~0.2。如果微生物培养基中含有碳酸钙，则无需调整pH值。

步骤四：培养基过滤

如果对配制的培养基没有特殊要求，这一步可以省略。中'海培养基如有浑浊和沉淀现象，可将需要澄清的液体培养基用油纸过滤。固体介质可以用双层纱布过滤，中间有一层薄薄的脱脂棉。 如果过滤法不能满足澄清要求，可以采用蛋清澄清法，即将培养基加热冷却至五十度至六十度，不超过三角瓶一半的容量。每一千毫升放入1~2个蛋清，用力摇晃三至五分钟，用121℃高压蒸汽灭菌二十分钟，趁热取出过滤。

步骤五：培养基分装

准备好的中.海培养基根据用途不同分为烧瓶、试管等容器，分装试管量大采用自动分液器，分装试管量小，可以用漏斗分液。分液量不超过容器体积的三分之二。三角瓶不要超过体积的二分之一；琼脂斜面不要超过试管长度的五分之一。灭菌后斜面应为培养基量的三分之一，底层应为培养基量的三分之二；半固态琼脂的体积为三分之一；

用于接种或保护细菌的高级琼脂，分装试管长度的三分之一和四分之一，接种厌氧菌的量应达到三分之二；琼脂平板90毫米内径13~15毫升，内径70毫米8~10毫升。如果琼脂平板表面较水，可将平板倒置，置于37℃培养箱中三十分钟，晾干后使用。每批培养基分装在二十毫升左右的小玻璃瓶中，与该批培养基同时灭菌，在以确定这批培养基的最终pH值。

步骤六：培养基灭菌处理

分装完成的培养基应马上灭菌。其杀毒灭菌方式主要有三种类型：

⑴高压蒸汽灭菌方式

此方法可用于大多数耐热培养基。对于小份：使用 121°C 十五分钟；大份：121°C 三十分钟；对于含碳水化合物的中.海培养基，仅需 113~115°C 十五分钟。灭菌以避免糖分的破坏。

⑵煮沸灭菌法方式

此方法可用于含有不耐高温物质的培养基。

⑶过滤除菌方式

过滤除菌，采用无菌技术定量添加培养基。血液和抗生素可以用无菌技术抽取并加入冷却至约五十度的培养基中。当中'海培养基中含有不耐热物质时可以使用此方法。

对LST培养基进行灭菌时，发酵管内可能存在气泡。为了防止发酵管内形成气泡，可以采取以下措施：

⑴倒置的小管充满培养基，不留气泡，然后加入含有 LST 的试管中。

⑵在关闭杀菌锅的排气阀之前，将锅内的气体排空。

⑶试管塞不要塞得太紧。使用硅胶塞时，请勿使用橡胶塞。

⑷不可过早打开杀菌锅，等杀菌锅内的气压和温度降到与室温相同或相差不大时再打开杀菌锅。

如果按照以上方法操作还有气泡，可以用水作为培养基组的对照试验。如果培养基组有气泡，对照组没有气泡，可以确定培养基本身原因。

步骤七：培养基倒入平板

将灭菌溶化的培养基冷却至五十度后，倒入无菌干燥的培养皿中。微生物培养基制备的温度不能太高，否则培养皿内盖容易形成过多的冷凝水；温度太低，中 海培养基容易凝固成块状，不能做成平板。倒平板时，要靠近酒精的火焰以防止外来细菌落入盘中。左手托住培养皿，右手托住三角瓶底部。用小指和手掌拉出锥形瓶的棉塞，烧灼烧瓶口，用拇指和食指在培养皿盖上打开一条缝，直到烧瓶口刚好伸手进去，倒入培养基，直到底部被覆盖。不要超过培养皿高度的三分之一，迅速盖上盖子，放在桌子上，轻轻旋转培养皿，使培养基分布均匀，凝结后即可。

步骤八：培养基摆斜面

灭菌完成后，将试管中的中海琼脂培养基放在木棒或玻璃棒上，同时它很热，并且有适当的坡度。冷却后使琼脂凝固并变成斜面。斜面长度不超过试管的二分之一。

步骤九：微生物培养基质检

检验培养基灭菌后，发现有破损，浸水，颜色异常，棉塞被培养基污染。所有这些都必须丢弃，不能重复使用，并确定其最终pH值。 无菌检查和效果检查也是必需的。无菌检查是取1~2瓶无菌培养基，37℃孵育一两天，确认无细菌生长；效果检查是将标准菌株接种到相关培养基上进行细菌检查。 动物的生长、形态和生化条件与已知条件一致。两个条件都合格，准备好的培养基就可以使用了。

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