培养基过度灭菌问题

培养基灭菌是灭菌类型中比较特殊的一类，除了要保证无菌之外，还要保持培养基的性能。不能一味的简单粗暴的提高灭菌条件，过度灭菌会造成培养基性能的损坏。虽然这些损坏在现有的分析条件下，可能第一时间或者永远不能察觉。

1、科学为了方便让步

除了基础培养基之外，其余培养基会因为各种各样的原因（抑菌效果、指示特性、高渗透压保持等等），需要添加不耐热的成分。理论上来说，对于某些培养基，无菌的不耐热补充成分应该在培养基冷却到 50°C 左右后添加。而且，因为非常冷的液体可能会导致琼脂凝胶化形成琼脂薄片，应先将补充成分加热至室温。推荐通过培养箱加热。补充剂需要轻轻彻底地混合到培养基中，然后尽快分配到最终平板中。

中国药典中收录培养基的配制过程也是如此描述的。但是，市场上的商业培养基几乎都是将所有成分都混合在一起，一起配制一起灭菌。严格意义上来说，与中国药典中规定的内容并不完全相符。那原因是什么呢？就是为了方便操作。所以针对那些已经让步的培养基灭菌条件一定要注意，千万不要过度灭菌。

2、过度灭菌难以发现 

过度灭菌是导致培养基pH 漂移、颜色变深、出现沉淀、凝胶强度差和生长性能下降的常见原因。如果加热容器底部出现部分培养基成分浓缩，也可以产生这些效果。所以所有培养基在灭菌前都应溶解。溶解将减少培养基中发生的美拉德型反应（非酶褐变）的发生。

一般情况下，培养基灭菌之后的颜色都是主观判断。由于并没有引入物理色度值测定，颜色变深很可能不被发现。不过，如果你能很好的使用化学灭菌指示胶带，在一堆瓶子中发现不同还是很可能的。但是，如果所有瓶子都过度灭菌也会无法发现。

另外，作为培养基性能标杆的对照培养基并没有规定具体灭菌条件。千万不要将对照培养基一起过度灭菌，不然很可能得出过度乐观的结论。

当保存在瓶中的琼脂培养基重新融化时，也会发生过热效应，要注意重新融化的方式。某些类型的培养基更容易受到这些影响，例如 pH 值等于或低于 5.0的琼脂培养基对过热特别敏感，因为琼脂会水解并且凝胶强度下降。建议将 pH 值低于5.0的培养基区别于标准培养基灭菌程序灭菌。

3灭菌误区

培养基灭菌保证无菌并不是要追求F0≥8。如果遇到灭菌不彻底的问题，要查找问题，不要简单延长灭菌时间或者提高灭菌温度。

灭菌失败可能原因：

灭菌锅性能下降，期间核查灭菌温度和保持时间是否能达到。（基础温度与时间）

灭菌容器中放置的生物指示剂有没有灭菌完全。（热穿透效果）

灭菌体积有没有超过1L/容器，装载量有没有过多。（验证范围的破坏）

培养基开瓶时间过长，保持不当，基础微生物超标。（保藏条件实在达不到，问问培养基生产商有没有小包装）

配制环境中污染菌过多。（比如梅雨季节，配制间条件无法控制）

配制过程时间过长。（尽你所能快配快灭，不要放置）

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