支原体培养基使用说明书-中海生物
日期：2023-11-06 | 中海生物技术文库 | 浏览：963 次
支原体培养基使用说明书
【产品名称】
中文名称：支原体培养基
英文名称：Myoplasma Medium
汉语拼音：Zhiyuanti Peiyangji
【性 状】 液体培养基为澄清，无杂质，玫瑰红色液体；固体培养基为淡黄色固体，加热融化后无絮状物或沉淀；固体培养基辅助液恢复至室温后为橙色液体。
【作用与用途】 用于非禽源性支原体检验。
【用法与判定】
1. 液体培养基 放在室温半小时回温，置于常温水中轻轻摇动融化，待全部融化后分装后使用。分装量为：小瓶20ml/瓶，小管1.8ml/支。
2. 固体培养基 固体培养基和辅助液放在室温半小时回温。将固体培养基塑料盖拧松一点，微波炉或水浴融化。微波炉融化时使用中火，每次1分钟，待全部融化后使用。辅助液置于常温水中轻轻摇动融化，待全部融化后使用。
当固体培养基温度降到50℃左右时，,辅助液37℃预热后缓慢贴壁加入，混合均匀后按平皿规格加入适量培养基（例如直径60mm的平皿加入固体培养基9ml）制成固体平板。
3. 检验 取样品5ml接种小瓶液体培养基，混匀后再从小瓶中取液体，分别移植到2支小管液体培养基（0.2ml/支）、2付固体平板（0.1~0.2ml/付），将小瓶与小管放37℃培养，固体培养基放置37℃、5%CO2培养箱中培养。接种后第5日、第10日、第15日从小瓶中取培养物移植2支小管液体培养基（0.2ml/支）和2付固体平板（0.1~0.2ml/付）。每日观察培养物颜色有无变黄或变紫红的现象，若无变化，在最后1次移植培养14日后停止观察。在观察期内，如小瓶或任何1支小管培养物颜色出现明显变化（pH变化达±0.5）时，应立即移植于2支小管液体培养基和2付固体平板进行培养，观察液体培养基是否出现恒定的pH变化以及固体培养基有无支原体菌落生长。
每次检验时，均应同时设立阴、阳性对照。阳性对照为接种1~10CFU/0.2ml质控菌液（猪鼻支原体BTS-7株）的小管液体培养基，和接种1~50CFU/0.2ml质控菌液的固体平板培养基；阴性对照为接种灭菌生理盐水的小管液体培养基和固体平板培养基，同上法培养和观察。
4. 结果判定
4.1 检测结果有效性 当阳性对照液体培养基出现颜色变黄，固体平板上出现支原体菌落；阴性对照液体培养基不变色，固体平板上无支原体菌落时，检验有效，并作如下判定。
4.2 判定 若接种样品的小瓶或小管培养基出现颜色变黄，且固体平板上可见支原体菌落，则判该样品有支原体污染。
【注意事项】
1. 培养基自低温环境取出，恢复到室温后使用。液体培养基和辅助液常温融化；固体培养基可微波炉或水浴加热融化。
2. 制备固体平板时，固体培养基冷却至50℃左右，,辅助液37℃预热后缓慢贴壁加入，轻摇混匀，避免出现气泡。
3. 进行培养基灵敏度检验时的器皿，必须达到细胞培养的要求。
4. 如液体培养基出现浑浊或颜色变化，固体培养基平板表面干裂，应停止使用。
【规 格】 支原体液体培养基80ml/瓶；支原体固体培养基60ml/瓶；支原体固体培养基辅助液13ml/瓶。
【贮藏与有效期】 支原体液体培养基-20℃以下保存，有效期为12个月；支原体固体培养基2~8℃保存，有效期为12个月；支原体固体培养基辅助液-20℃以下保存，有效期为12个月。
附：培养基检验
1. 质控菌株 检验用质控菌株为猪鼻支原体BTS-7株。将冻干种子恢复原量以10%的量接种支原体液体培养基，经35~37℃培养至变色，作为第1代；将第1代培养基物按10%接种量接种支原体液体培养基，35~37℃培养12~72h，取活菌滴度≥108CCU/ml培养物作为工作种子。在使用过程中冻干种子传代次数不超过5代，工作种子在-20℃以下保存有效期为20日。
2. 检验方法
2.1 灵敏度试验
（1）培养 取工作种子液用待检液体培养基进行10倍系列稀释至10-10，另设1支未接种液体培养基作为对照，置35~37℃培养5~7日；取10-6稀释度菌液0.2ml接种于固体培养基平板1个，另设1个未接种固体培养基平板作为对照，置37℃、5%CO2培养箱中培养5~7日。同时各做2组重复。
（2）结果判定 以培养基呈现生长变色的最高稀释度作为其灵敏度。如果2组培养基灵敏度均≥10-8，对照不变色；固体培养基均有支原体菌落生长，对照无支原体菌落生长，判培养基合格。若仅1组液体培养基灵敏度≥10-8，或1组固体培养基有支原体菌落生长，取2倍待检品重检。重检后，如液体培养基灵敏度均≥10-8，固体培养基均有支原体菌落生长，判为合格。否则，判为不合格。
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